ELISA

一．实验原理

ELISA，即酶联免疫吸附实验，其基本原理是将一定浓度的抗原或者抗体通过物理吸附的方法固定于聚苯乙烯微孔板表面，加入待检标本，通过酶标物显色的深浅间接反映被检抗原或者抗体的存在与否或者量的多少。ELISA技术作为免疫标记技术（包含免疫荧光技术，免疫放射技术，免疫酶技术和免疫胶体金技术）中的一种，已广泛应用于科研和临床实验中，具有快速，定性或者定量甚至定位的特点。

在ELISA实验方法中，比较常见的方法有双抗体夹心法，竞争法，间接法，双抗原夹心法，捕获法，下面对此一一详述。
1.双抗体夹心法
    双抗体夹心法，其基本原理是将一定量的包被抗体以物理吸附的方法固定于聚苯乙烯微孔板表面，加入无关蛋白载体封闭未结合位点，然后加入待检标本，通过加入检测抗体，酶标记第二抗体后用TMB底物显色，微孔板中颜色的深浅与待测物的浓度呈正相关。
    该方法的适用条件是：含有多个抗原表位的大分子物质。因为这种检测方法需要两种抗体，所以就涉及抗体配对的问题。一般而言，常用的抗体配对方法有一下几种：包被抗体为单抗，检测抗体为多抗；包被抗体为单抗，检测抗体为单抗，但这两种单抗针对的抗原表位不同；包被抗体为多抗，检测抗体为多抗，这两种多抗一般是来源于不同的宿主。
    这种检测方法在应用酶标第二抗体时，应该注意的一个原则是：第二抗体必须只能针对检测抗体，而不能针对包被抗体。鉴于酶标二抗的局限性，现在一般厂家都引入生物素亲和素放大系统，这种系统在提高反应灵敏度的同时，应用起来也更加方便，我们只需要对检测抗体进行生物素标记，不需要对每一种不同来源的二抗进行酶标记，只需对亲和素做HRP标记就可以省去很多繁琐的工作。
2.竞争法
    竞争法一般分为直接竞争法和间接竞争法，这里我们以直接竞争法为例进行原理讲解。直接竞争法，其基本原理是：将合适浓度的包被抗体包被于微孔板中，加入无关蛋白载体封闭未结合位点，加入标准品（样本）和生物素标记的抗原物质进行竞争结合，经合适的温度和一定时间的孵育，洗涤后，加入HRP标记的链霉亲和素进行反应，TMB显色，微孔板中颜色的深浅与待测物的浓度呈负相关。
    该方法一般用来检测具有较少表位的小分子物质，当然，这种方法也可以用来检测大分子抗原物质甚至是抗体。检测大分子抗原物质时，由于空间位阻的影响，使得该检测方法没有双抗体夹心法检测大分子抗原物质灵敏度高。这种方法在检测抗体时，可能由于两种竞争的抗体来源不一，导致两种抗体趋同性不高，就使得检测结果的可靠性不高。
3.间接法
    间接法一般用来检测抗体。其基本原理是：将一定量的抗原物包被于聚苯乙烯微孔板，加入无关蛋白载体封闭未结合位点后，加入待测样本，然后加入酶标二抗，经孵育和洗涤后，加底物显色。一般而言，在间接法检测抗体实验中，由于酶标二抗的局限性，一般检测的抗体为总的IgG。
4.双抗原夹心法
    双抗原夹心法，与双抗体夹心法类似，基本原理是将已知浓度的抗原固定于聚苯乙烯微孔板表面，对未结合位点用无关蛋白载体进行封闭后，加入待检样本，然后加入生物素标记的抗原和HRP标记的链霉亲和素，经TMB显色和终止反应，酶标仪读数之后即可计算待测物浓度。双抗原夹心法与间接法都可以对抗体进行检测，但是前者检测的是针对该抗原的所有种类的抗体，包含IgG, IgM, IgA，IgD, IgE，这是间接法做不到的。
5.捕获法
    捕获法一般用来测定IgM类抗体。其基本原理是：将抗IgM 抗体包被于固相微孔板，用无关蛋白载体对未结合位点进行封闭后，加入待测样本，接着加入抗原物质，然后加入针对该抗原的经生物素标记的特异性抗体和HRP标记的链霉亲和素，经TMB底物显色和终止反应后即可计算浓度。

由于我们检测样本中的IgM含量时，其中同时含有较高浓度的IgG类抗体，在用一般的间接法检测时，IgG类抗体和IgM类抗体会和固相抗原进行竞争性结合，由于IgG占据绝对优势，势必导致IgM类抗体能够结合上去的量相当有限，最终导致的结果是假阴性。

二. 实验步骤

1. 样本预处理

血浆/血清/细胞上清/尿液：3000rpm离心10min，取上清检测。

组织匀浆：用预冷的PBS (0.01 M,pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液，称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS(一般按1: 9的重量体积比，比如1g的组织样品对应9 mL的PBS)加入组织研磨器中，充分冰浴研磨。最后将匀浆液3000rpm离心 10分钟，取上清检测。

细胞提取液：贴壁细胞用冷的PBS轻轻清洗，然后用胰蛋白酶消化，1000×g离心5分钟后收集细胞；悬浮细胞可直接离心收集。收集的细胞用冷的PBS 洗涤3次。每 1×10^6 个细胞中加入200μL PBS重悬并通过反复冻融使细胞破碎。将提取液于3000rpm离心10分钟，取上清检测。

2. ELISA实验步骤

实验开始前，各试剂均应平衡至室温；试剂或样品配制时，均需充分混匀，并尽量避免起泡。

1）  加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加标准品&样品稀释液100μL，余孔分别加标准品或待测样品100μL。给酶标板覆膜，37℃孵育90分钟。（加样顺序及相应编号见excel表中相关内容！）

2）  弃去孔内液体，甩干，不用洗板，每孔中加入生物素化抗体工作液100μL（在使用前20分钟内配制），给酶标板加上覆膜，37℃温育1小时。

3）  弃去液体，洗板3次，每次浸泡30S，大约350μL /每孔，甩干并在吸水纸上轻拍将孔内液体拍干。

4）  每孔加酶结合物工作液100μL（临用前20分钟内配制，避光放置），加上覆膜，37℃温育30分钟。

5）  弃去孔内液体，甩干，洗板5次。

6）  每孔加显色剂（TMB）90μL，酶标板加上覆膜37℃避光孵育15分钟。

7）  每孔加终止液50μL，终止反应，此时蓝色立转黄色。

8）  立即用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度（OD值）。应提前打开酶标仪电源，预热仪器，设置好检测程序。

9）  实验完毕后，未使用完的试剂按规定保存温度放回冰箱保存。