免疫共沉淀(Co-IP)

一、实验原理

免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation，Co-IP)是研究蛋白质一蛋白质相互作用的常用技术，通常用于测定两种已知蛋白质能否在细胞内结合产生相互作用，以及用于确定与某种特定蛋白质具有相互作用的未知蛋白质。该法的优点是蛋白质处于天然状态，蛋白质的相互作用可以在天然状态下进行，可以分离得到天然状态下相互作用的蛋白质复合体。

Co-IP的原理与免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP)大致相似，都由特异抗体与待检样品中相应的特异抗原结合形成抗原一抗体免疫复合物，然后复合物吸附于固化了蛋白A或G的支持物上(蛋白A或G具有吸附抗体的能力)，相应的抗原分子也同时被吸附。免疫复合物被吸附到支持物上的过程即为沉淀(Precipitation)。没有被沉淀的蛋白质随着缓冲液的流洗而被除去。但在免疫共沉淀中，与靶抗原一起被沉淀的还有靶抗原的相互作用蛋白质，即随着抗体被吸附于固化了蛋白A或G的支持物上，相应的抗原及其相互作用蛋白质也同时被沉淀。最后，采用相互作用蛋白质的特异抗体经Western Blot检测，以证实二者存在相互作用。

二、实验步骤

1)        总蛋白提取：

①　细胞样品准备：3000rpm离心5min收集细胞，PBS漂洗，加入适量modified RIPA Buffer（含蛋白酶抑制剂），冰上裂解30min，然后于4℃，12000rpm离心20min取上清；

②　组织样品准备：取适量组织，PBS漂洗，加5倍体积预冷的modified RIPA Buffer于冰上充分匀浆，约5min，然后于4℃，12000rpm离心20min取上清；

2)        取少量上清以备Western Blot分析，剩余上清加1μg相应的抗体，4℃缓慢摇晃孵育过夜；

3)        protein A beads 预洗：取10μL protein A beads，用适量modified RIPA Buffer洗3次，每次3000rpm离心3min，再用modified RIPA Buffer调整成体积比为50%混悬液；

4)        将预洗的10μL protein A beads加入2)中和抗体孵育过夜的modified RIPA Buffer，4℃缓慢摇晃孵育2-4h，使抗体与protein A beads充分偶连；

5)        4℃，3000rpm离心3min，弃上清，1mL modified RIPA Buffer洗3-4次；加入15μL的2×SDS上样缓冲液，沸水煮5分钟；

6)        Western Blotting分析，确定结合蛋白。

三、注意事项

1. 抗原没有免疫沉淀下来：

1)        样品中所含的抗原过少，不足以被检测，通过Western Blot验证裂解液中蛋白的表达及裂解效率；如果需要，加大样品量；

2)        抗体无法结合抗原，使用新生产的特异性抗体，或者选择另一种识别不同抗原表位的抗体；

3)        modified RIPA Buffer中的成分干扰抗体抗原的结合，尝试更换其他裂解液。

2. 洗脱下的抗体条带掩盖了目标抗原：

抗原的分子量大约是50kDa或25kDa，Western Blot实验选择使用与免疫共沉淀抗体不同种属的抗体。

3. 获得蛋白量低：

1)        蛋白降解，加入蛋白酶抑制剂。

2)        所用beads量不够，加大免疫复合物使用的beads量。

3)        样品中目标蛋白量不够，提高样品量。

4. 多条非特异条带：

有非特异性的蛋白结合在beads上，可以尝试提高modified RIPA Buffer中NaCl浓度

5. beads聚集：未按步骤预洗beads。