凝胶迁移实验（Electrophoretic mobility shift assay，EMSA）

一．实验原理

     凝胶迁移实验（Electrophoretic mobility shift assay，EMSA）是一种研究DNA结合蛋白质和相关的DNA结合序列相互作用的技术，可用于定性和定量分析。基于DNA-蛋白质或RNA-蛋白质复合体在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）中有不同迁移率的原理，当转录因子与特异的DNA或RNA结合后，其在PAGE中的迁移率将小于未结合核蛋白转录因子的DNA，从而检测到活化的与DNA或RNA结合的蛋白转录或调节因子。

二. 实验步骤

1、6%非变性聚丙烯酰胺凝胶的配制：在15 ml试管中，按顺序放入ddH2O 7.15 ml ，30%聚丙烯酰胺溶液2 ml，5×TBE 1 ml，甘油175 μL，10% APS 75 μL，TEMED 8 μL；

2、4℃，100 V电压，0.5×TBE预电泳约60 min；

3、根据PIERCE公司EMSA试剂盒（货号：20148）要求配制结合反应液，加入生物素标记的探针，室温放置30 min；

4、加入5 μL Loading Buffer到每一个结合反应中，混匀，上样；

5、4℃，100 V电压0.5×TBE电泳，至溴芬兰电泳至2/3凝胶长度时停止电泳；

6、转膜：将合适大小的尼龙膜浸泡在0.5×TBE中15 min，按照夹心法依次将海绵、滤纸、凝胶、尼龙膜、滤纸、海绵顺序放好，筛孔板固定，细心去除夹心内所有气泡，凝胶面向阴极插入电泳槽中，倒入0.5×TBE，380 mA恒流电转移35 min；

7、紫外交联 10min；

8、化学发光法检测生物素标记的DNA：参照PIERCE公司LightShift® Chemiluminescent EMSA Kit说明操作；

9、50℃水浴温和地将封闭缓冲液（blocking buffer）和4×漂洗缓冲液（Wash Buffer）预热，直至颗粒物全部溶解；

10、将膜放入洁净的塑料平皿中，加入20 ml封闭缓冲液，放在摇床上温和摇动15 min；

11、吸取66.7 μL辣根抗生物素蛋白链菌素过氧化物酶底物到20 ml封闭缓冲液，混匀备用；

12、将封闭缓冲液倒去，加入步骤10所配溶液，放在摇床上温和摇动15min；

13、取40 ml 4漂洗缓冲溶液到120 ml ddH2O中，得到1漂洗缓冲溶液；将膜转移到一个新的塑料平皿，加入20 ml 1漂洗缓冲溶液漂洗5min，共漂洗4次；

14、将膜转移至另一新的塑料平皿，加入30 ml底物平衡缓冲液，平衡5min；

15、配置底物工作液（Substrate Working Solution）：将6 ml Luminol/Enhancer Solution加入到6 ml Stable Peroxide Solution中，混匀，避光保存备用；

16、将膜从底物平衡缓冲液中拿出，正面朝上放到新的洁净平皿中，将底物工作液倒入膜的表面，避光放置5 min；

17、将膜从底物工作液中取出，用塑封膜封好，避免气泡和皱褶；

18、曝光，记录结果。

三、常见问题

1、为什么看不到迁移带？

1）蛋白样本提取质量不高，蛋白降解或者提取量不足。

2）样本中没有可以与探针结合的蛋白。

3）探针与蛋白无特异性的相互作用。

4）转膜效率低，蛋白或者探针未转移到膜上。

5）曝光或者成像时间过短。

在Super-Shift EMSA测定中看不到Super-Shift DNA/蛋白复合物带还可能有以下原因：

6）抗体没有工作。不是所有的抗体都可以用于Super-Shift EMSA，只有对非变性蛋白的表面抗原决定簇起反应的抗体才能够用于Super-Shift EMSA。

7）测定的活化的DNA/蛋白复合物中没有希望检测的构成成分存在。此时既看不到Super-Shift的带，也看不到DNA/蛋白复合物的量的减少。

8）使用的抗体过度稀释。一般10-20ul的反应液需要使用0.5-1ul原倍的抗体 。

9）多抗与DNA/蛋白复合物形成大的聚集物而不进胶。在这种情况下，虽然看不到Super-Shift的带，但应当可以看到DAN/蛋白复合物的电泳带明显减少。

2、为什么实验背景高？

1）曝光或者成像时间过长。

2）封闭时间不足或者效率不高。

3）洗涤效果不佳

4）实验过程中膜没有一直处于湿润状态。

3、EMSA测定需要多少量的蛋白与标记的探针？

1）对每一个特定的结合蛋白和探针，所用的纯化蛋白，部分纯化蛋白，粗制核抽提液需作优化：一般所用纯化蛋白的量在20-2000ng间，可将蛋白:DNA的等摩尔比调整为蛋白的摩尔数是DNA的5倍；用粗制核抽提液，需要2-10ug蛋白形成特异的复合物。

2）部分纯化蛋白与粗制核抽提液应保存在-80℃、探针应保存在-20℃以防止降解。

3）无论探针或是结合蛋白都应避免多次冻融。

4、Poly(dI:dC)，非特异性竞争DNA，特异性竞争DNA在EMSA测定中的作用？

Poly(dI:dC)由肌苷和胞嘧啶组成。在EMSA反应中加入poly(dI:dC)，可抑制粗制核抽提液中转录调节因子与标记探针的非特异结合。结合溶液中的poly(dI:dC)的用量需在正式实验前进行优化，一般用量大约在0.05mg/ml左右。当用纯化的蛋白作凝胶迁移反应时，不必一定加入poly(dI:dC)，如加入，则普通反应中所用终浓度不超过50-100ng。对核抽提液，每2-3ug核抽提液用1 ug poly(dI:dC)。

为确定所形成的复合物的特异性，在含或不含增量的特异竞争DNA或非特异的竞争DNA时，作结合反应的竞争实验。一般，特异竞争探针是非标记的DNA，其序列与标记探针相同，故能与标记探针竞争与结合蛋白的反应。非特异竞争探针的长度组成和DNA探针相同，但序列不同。如果结合蛋白与标记探针的结合被特异竞争探针抑制，而不受非特异探针的影响表明靶结合蛋白的存在。特异与非特异性竞争DNA的用量也需优化或滴定，但竞争DNA通常是标记的探针用量的30-100倍（w/w）。

5、用什么凝胶条件将蛋白质/探针复合物和游离的探针分离开？

    将结合蛋白或粗制核抽提液和目的探针结合，蛋白/探针复合物和游离探针可在非变性聚丙烯酰胺凝胶中经电泳分离。聚丙烯酰胺的浓度一般为6%，在特定条件下可用高或低的浓度。也可将TGE缓冲液（12.5 mM Tris，pH8.3，95 mM 甘氨酸，0.5 mM EDTA）用于不稳定的蛋白/DNA复合物。在4 ℃进行结合和电泳实验以阻止不稳定复合物和探针的解离。

当带型不紧密出现拖尾时，表明复合物存在解离。凝胶必需完全聚合，以避免带型拖尾。如复合物不进入凝胶则表明所用的蛋白或探针过量，或盐的浓度过量不适用于这一反应。在含抽提液的带中不含游离探针或复合物，但只含探针的带中有探针表明抽提物有核酸或磷酸酶污染，应在抽提液中和结合反应中加入相应的抑制剂。