荧光定量PCR(SYBR Green)

一．实验原理

在定量PCR（也称rt-PCR或qPCR）中，荧光信号是由荧光探针或荧光DNA结合染料（如SYBR Green）产生，其强度与PCR产物分子（扩增子）的数量成正比。每个循环结束时，收集荧光信号强度，通过将荧光强度与循环数作图，qPCR仪生成扩增曲线，其表示在整个PCR过程中产物的累积，通过这个过程，即可实现量化。如果样品中特定的序列（DNA或RNA）丰富，则在较早的循环中观察到扩增，Ct值小;如果序列稀少，则在稍后的循环中观察到扩增，Ct值大。

二．实验步骤

RNA 提取 → 反转录 → 设计引物 → Q-PCR

1 总RNA提取

A组织样本：迅速将新鲜的组织切成合适的大小，在液氮中充分研磨后加裂解液裂解，或直接加入裂解液后用匀浆器匀浆。每30-50mg组织加1ml Trizol。

B全血样品：加入3-5倍体积的红细胞裂解液到血样中，室温孵育10min，室温3500rpm离心6min。弃上清，原每2-3ml全血样品加1mL Trizol。

C细胞样品：悬浮液中生长的细胞，通过离心收集细胞后，每1×10⁵〜10⁶细胞加入1mL Trizol，移液器吹打混匀，直接裂解或-80℃储存一个月。贴壁生长的细胞，有两种处理方法。一种是移除培养基后，将1mL Trizol直接加入直径3.5cm的培养皿中裂解细胞。或是先用胰蛋白酶将贴壁细胞消化下来并收集后，再加入1mL Trizol进行裂解。（Note：加入Trizol前, PBS充分洗涤细胞去除残余培养基。）

1.1 直接法

1）加入1ml Trizol试剂，混匀，冰上孵育10min。

2）4℃，12000rpm离心10min，小心转移上清液到不含颗粒的新EP管中。

3）加入200ul氯仿，剧烈振荡15秒，室温孵育5min。

4）4℃，12000rpm离心15min。混合液分三层，包括最下面的苯酚 - 氯仿有机相，中间相和上层水相。小心转移上层水相到新的EP管（大约60％体积的Trizol），不要吸取中间相，可留下少量上层液体！（Note：质量比数量更重要！）

5）加入等体积的异丙醇，轻轻地颠倒混匀约10次，室温放置10min。

6）4℃，12000rpm离心10min。弃上清，1ml 75％乙醇洗涤RNA沉淀两次。

7）4℃，12000rpm离心5min，弃上清，室温下风干5-10min（不要太干，过度干燥会导致RNA难溶解！）。将RNA溶于15μl-50μlDEPC水中。

8）立即进行反转录反应，或先-80℃长期保存。

1.2 离心柱法(依据RNA提取试剂盒说明书)

1）4.1.1中步骤1）—4）。

2）加入1/2体积的无水乙醇，轻柔颠倒混匀。如有透明的纤维状物体，不影响下游步骤。

3）将所有裂解物/乙醇混合物转移至离心柱，置于2mL，静置2min。4℃，12000rpm离心3min，弃废液。

4）加入500uL洗涤液，静置2min。4℃，12000rpm离心30秒，弃废液。重复一次。

5）4℃，10,000rpm离心2min以除去残留的乙醇。

6）将离心柱置于新的RNase-free EP管中，加入30ul-50ulDEPC水，静置5min， 12000rpm离心2min收集。

7）立即进行反转录反应，或先-80℃长期保存。

2 反转录

2.1  RNA纯度和完整度鉴定

紫外分光光度法测定RNA浓度和纯度

在pH8.0的TE缓冲液（在酸性缓冲液中，Abs 260nm：280nm比值会偏低）稀释RNA，并在260nm和280nm下测量吸光度。

RNA 浓度= 40ug/mL×稀释倍数×Abs 260nm

一般Abs 260nm：280nm比率应该是1.7-2.1，说明RNA的纯度较好。 RNA产量会根据材料的类型和数量以及储存条件的不同而变化。

RNA条带完整度测定

为了评估RNA的完整性，取部分样本做琼脂糖凝胶电泳。完整的RNA条带包括28S，18S和5S核糖体RNA。通常，28S / 18S> 2意味着RNA具有较高的完整度。

2.2反转录

准备反应主混合物。 每个反应：

PCR条件：42℃孵育40min，85℃加热5min，4℃保存。

将第一链cDNA储存在-20℃。

2.3 引物设计

在Primer5.0软件上设计特异引物。

引物设计标准

1）PCR扩增子长度：50-180bp；

2）引物长度17-25bp；

3）GC含量：45-55％；

4）Tm：58〜68℃，引物对间差异不大于2℃；

5）碱基要随机分布，尽量均匀。3′端要避开AT，GC rich的区域，避开T/C或A/G连续结构（2-3个）。引物自身和引物间不能存在互补。引物3’末端为G或C；

6）避免DNA污染，跨外显子接头区；

7）至少设计2-3对引物，预实验筛选最佳引物；

8）将所有设计的引物在NCBI数据库中比对以确定它们对靶基因特异性。

3 Q -PCR 反应

扩增循环:

预变性     95℃ 300s；

变性       95℃ 20s；

退火       55℃ 20s；   n=40 Cycles

延伸       72℃ 20s；

熔解程序:

扩增循环结束后，降温至60℃，然后加热升温至95℃变性DNA产物。