Western Blot
| 产品编号 | 产品名称 | 规格 | 价格 |
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Western Blot
一．实验原理
蛋白免疫印迹（ Western Blot，WB）是将蛋白样本通过聚丙烯酰胺电泳按分子量大小分离，再转移到杂交膜（blot）上，然后通过一抗/二抗复合物对靶蛋白进行特异性检测的方法。 WB 是进行蛋白质分析最流行和成熟的技术之一。
二. 实验步骤
1. 细胞裂解
1）培养的细胞经预冷的 PBS 漂洗 2 次；
2）吸净PBS，加入预冷的裂解液（使用前裂解液中加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂）(0.1 ml /10６ cells)；用细胞刮子刮取贴壁细胞，将细胞及裂解液温和地转移至预冷的离心管中；不能用细胞刮子刮取的情况可直接冰上裂解30min后用枪多次吹打至细胞完全裂解；
2）4℃摇动 30 min；
3）4℃离心 12000 rpm，20 min；
4）轻轻吸取上清，转移至新预冷的离心管中置于冰上，即为蛋白样本，弃沉淀。蛋白样本暂时不作处理时可以放入-80℃保存。
5）目的蛋白非细胞外基质（ECM）或对胰酶不敏感时也可以采用胰酶消化法收集细胞（即细胞吸去培养基，PBS 漂洗 2 次，加入胰酶消化至脱落，加入预冷的PBS，移入预冷的EP管，离心收集细胞，加入预冷裂解液（使用前加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂），依次按上面4，5，6步骤处理。
2. 组织裂解
1） 用预冷的工具分离目的组织，尽量置于冰上以防蛋白酶水解；
2） 将组织块放在圆底的微量离心管或 EP管中，加入液氮冻结组织于冰上均质研磨，长期可保存于-80°C；
3） 每约10 mg组织加入约200 μl 预冷的裂解液（使用前加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂），冰浴匀浆后置于4℃摇动2h，裂解液体积与组织样本量有适当比例（最终的蛋白浓度至少达到1 mg/ml，理想的蛋白浓度应为1-5 mg/ml).
4） 4℃离心 12000 rpm，20 min，轻轻吸取上清，转移至新预冷的微量离心管中置于冰上，即为蛋白样本，弃沉淀。蛋白样本暂时不作处理时可以放入-80℃保存。
3. 蛋白定量
BCA 法以牛血清白蛋白 (BSA) 作为标准曲线。基于双缩脲原理，碱性条件下蛋白质将 Cu2+ 还原成 Cu1+， BCA（Bicinchoninic 酸）螯合 Cu1+ 作为显色剂，产生兰紫色并在 562 nm 有吸收峰，单价 Cu1+ 与蛋白呈剂量相关性，灵敏性很高，试管法可测范围 20-2000 μg/ml，微孔法为 0.5-10μg/ml。不易受一般浓度去污剂的干扰。可耐受螯合剂、略高浓度的还原剂的影响，40min内抗干扰能力强。
BCA测定方法如下：
1) 标准曲线的绘制：取一块酶标板，按照下表加入试剂：
孔号 | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
蛋白标准溶液（μL） | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
去离子水（μL） | 20 | 19 | 18 | 17 | 16 | 15 | 14 | 13 |
对应蛋白含量（μg） | 0 | 5 | 10 | 15 | 20 | 25 | 30 | 35 |
2) 根据样品数量，按 50 体积 BCA 试剂 A 加 1 体积 BCA 试剂 B（50:1）配制适量 BCA 工作液，充分混匀；
3) 各孔加入 200μL BCA 工作液；
4) 把酶标板放在振荡器上振荡 30sec，37℃放置 30 min，然后在 562nm 下比色测定。以蛋白含量（μg）为横坐标，吸光值为纵坐标，绘出标准曲线；
5) 稀释待测样品至合适浓度，使样品稀释液总体积为 20μL，加入 BCA 工作液 200μL，充分混匀，37℃放置 30 min后，以标准曲线 0 号管做参比，在 562nm 波长下比色，记录吸光值；
6) 根据所测样品的吸光值，在标准曲线上即可查得相应的蛋白含量（μg），除以样品稀释液总体积（20μL），乘以样品稀释倍数即为样品实际浓度（单位：μg/μL）。
4. 电泳上样样品的准备
一般的抗体只能识别抗原蛋白中的部份序列结构（表位），因此，为使抗体能够达到结合该表位而需要将蛋白样本进行变性，使之打开折叠的空间结构，蛋白变性一般使用含阳离子变性去污剂如 SDS 的上样 buffer （loading buffer），并于 95-100°C 煮沸5 min，对于多次跨膜蛋白，可以于 70°C 加热 5-10 min，本实验室的 上样 buffer 称为5×SDS凝胶还原型加样缓冲液，上样时与样本1：4混合后变性上样即可。
SDS是阴离子去污剂、变性剂。氨基酸侧链与 SDS 充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS 胶束，蛋白质-SDS 胶束所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，消除了不同分子之间原有的电荷差异，SDS与强还原剂一起使蛋白分子氢键、疏水键打开，使蛋白质分子线性化。
5、 电泳
SDS-PAGE基本原理：
1） SDS-PAGE 是在蛋白质样品中加入 SDS 和含有巯基乙醇的样品处理液，SDS 是一种很强的阴离子表面活性剂，它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。
2强还原剂巯基乙醇（或二硫苏糖醇，DTT）可以断开二硫键破坏蛋白质的四级结构。使蛋白质分子被解聚成肽链形成单链分子。解聚后的侧链与 SDS 充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS 复合物。
3）蛋白质分子结合 SDS 阴离子后，所带负电荷的量远远超过了它原有的净电荷，从而消除了不同种蛋白质之间所带净电荷的差异。蛋白质的电泳迁移率主要决定于亚基的相对分子质量，而与其所带电荷的性质无关。
5.1 PAGE胶的制备
聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel)是由单体丙烯酰胺（acrylamide，简称 Acr）和交联剂N,N’-亚甲基双丙烯酰胺(N,N’-methylenebisacylamide，简称 Bis）在催化剂（过硫酸胺或核黄素 AP）和加速剂（四甲基乙二胺 TEMED）作用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶。化学惰性强，具有一定的机械强度和透明度。是良好的电泳介质。
聚丙烯酰胺凝胶聚合机理是通过提供氧游离基的催化，使体系发生氧化还原作用来完成的。催化体系主要有化学催化（AP-TEMED）和光化学催化（核黄素-TMTED）体系。
SDS-PAGE胶有效分离范围
聚丙烯酰胺胶浓度% | 线性分离范围/kDa |
5 | 57-212 |
7.5 | 36-94 |
10 | 20-80 |
12 | 12-60 |
15 | 10-43 |
5.2上样电泳
蛋白抗原上样量为30 ug。根据样品量选择SDS-PAGE电泳玻璃板间隙厚度，一般0.75mm间隙15孔的上样量 < 15uL/孔，1mm间隙10孔的上样量 < 30ul/孔。
电泳：用二根导线连接电泳槽与电泳仪，注意红色与黑色电极的插头和插口相配。电泳时上层胶使用低电压恒压电泳，打开电源将将电压调到80v（一般15min左右），而在溴酚蓝进入下层胶时使用高压恒压电泳，将电压调到120v至溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳。
6. 转膜与显色
6.1 蛋白转膜
湿式转膜三明治排列为：海绵/滤纸/ 胶/ 膜/滤纸/ 海绵，全部紧密排列，特别是胶/膜之间不能留有气泡，三明治安放的方向确认正确，负极方为带负电的胶里的蛋白，向正极方（膜）电迁移。SDS-PAGE电泳完毕，用刀片或薄板将凝胶板的两块玻璃轻轻撬开，使凝胶倾伏在其中一块玻璃板上。用刀片在凝胶上沿分离胶与浓缩胶的交界处，将分离胶切下，并在分离胶的左上角切掉一小角，以标记样品顺序。然后将胶小心移入转膜缓冲液中。剪下与分离胶同样大小的0.45um的PVDF膜，以甲醇浸泡5s。剪下6张同样大小的滤纸，与PVDF膜，胶同时以转移缓冲液平衡15min。在转膜装置上从负极（黑底）到正极放置海绵垫片、滤纸、胶、膜、滤纸、海绵垫片（由下而上），放置时一定要排除气泡，特别是膜与滤纸、胶与膜、滤纸与胶之间。设置转膜电流为恒流，200mA，时间约需40min（蛋白大小不同所需时间不同，一般1KD约为1min）。转完后，取出膜，在与胶相同的位置小心剪去一角，标示电泳方向及吸附有蛋白的膜面。
a) 大蛋白（大于 100 KD）
1) 对于大蛋白而言，其在凝胶电泳分离迁移较慢，而从凝胶转出也非常慢，因此对于这种大分子量蛋白应该用低浓度的凝胶， 8% 或更低，但因低浓度的胶非常易碎，所以操作时需十分小心，
2) 大蛋白易在凝胶里形成聚集沉淀，因此，转膜时在电转移缓冲液加入终浓度为 0.1%的 SDS，以避免出现这种情况，甲醇易使SDS 从蛋白上脱失，因此应降低电转移缓冲液中甲醇的浓度至 10%或更低，以防止蛋白沉淀。
3) 降低电转移缓冲液中甲醇的比例以促进凝胶的膨胀，易于大蛋白的转出。
4) 如果使用硝酸纤维素膜，甲醇是必需的，但如果是 PVDF 膜，甲醇可以不必加入电转移缓冲液中，但转膜前PVDF 需用甲醇活化。
5) 选择湿式， 4℃ 转膜过夜，以取代半干式转膜。
b) 小蛋白（小于 20 KD）
1) SDS 妨碍蛋白与膜的结合，特别是对小蛋白更是如此，因此，对于小分子的蛋白，电转移缓冲液中可以不加 SDS。
2) 保持 20% 的甲醇浓度。
6.2 膜的封闭
杂交膜上有很多非特异性的蛋白质结合位点，为防止这些位点与抗体结合引起非特异的染色和背景，一般用惰性蛋白质或非离子去污剂封闭膜上的未结合位点来降低抗体的非特异性结合。封闭剂应该封闭所有未结合位点而不替换膜上的靶蛋白、不结合靶蛋白的表位，也不与抗体或检测试剂有交叉反应。最常见的封闭剂是 BSA、脱脂奶粉、酪蛋白、明胶和 Tween-20（0.05 - 0.1%）稀溶液 PBST 或者 TBST。
Tween-20 的作用：Tween-20 是一种非离子型去污剂，有复性抗原的作用，可提高特异性的识别能力。在做 westen blot 时，用惰性蛋白质或非离子去污剂封闭膜上的未结合位点可以降低抗体的非特异性结合。Tween 这种非离子型去污剂在乳化蛋白时，不破坏蛋白的结构，可减少对蛋白质之间原有的相互作用的破坏。离子型去污剂如 SDS 则破坏蛋白的结构。
传统上有两种封闭液：脱脂奶粉或 BSA。脱脂奶粉不能与生物素化或伴刀豆蛋白标记的抗体一起使用，因为脱脂奶粉含有糖蛋白和生物素。如果封闭剂中含磷酸酶，用磷酸化特异性抗体分析磷酸化蛋白受到影响，因为磷酸酶与印记膜上的磷酸化蛋白接触可使之去磷酸化。检测磷酸化抗体时，不能使用酪蛋白/脱脂奶粉作为封闭剂。某些抗体用 BSA 封闭时因不明原因可能会产生比脱脂奶粉更强的信号，请仔细阅读说明书注明的注意事项和膜的特殊的封闭方法。
一般封闭条件为：5% 脱脂奶粉或 BSA 溶液室温或者 37℃缓慢摇荡 1-2 h，特殊情况也可 4℃过夜。根据结果情况调整封闭试剂的浓度和类型。封闭完成后进行洗膜，在方形保鲜盒中加入TBST，将膜放入其中，使TBST没过PVDF膜，在摇床上低速震荡10min洗1次。
6.3 一抗的孵育
吸尽封闭液后，立即加入稀释好的一抗，室温或 4℃在摇床上缓慢摇动孵育2 h。孵育时间：一抗的孵育时间可从2h至过夜（一般不超过 18 h）不等，取决于抗体与蛋白的亲和性和蛋白的含量丰度，建议使用较高的抗体稀释倍数和较长的孵育时间来保证特异性结合。
孵育温度：尽可能低温孵育，如果在封闭液中孵育一抗过夜，应在 4℃进行否则会产生污染而破坏蛋白（降别是磷酸基团）。
孵育一抗时需保持适当的摇动使之均匀覆没膜，防止结合不均匀。
孵育完成后吸取一抗，在方形保鲜盒中加入TBST，将膜放入其中，使TBST没过PVDF膜，在摇床上低速震荡10min，重复洗3次。
6.4二抗孵育
用封闭液稀释二抗至抗体说明书规定浓度，将转有蛋白的PVDF膜浸入装有抗体的方形保鲜盒中，震荡孵育1-2 h。孵育完成后吸取二抗，在方形保鲜盒中加入TBST，将膜放入其中，使TBST没过PVDF膜，在摇床上低速震荡10min，重复洗3-5次。
6.5化学发光
辣根过氧化物酶在H2O2 存在下，氧化化学发光物质鲁米诺（luminol，氨基苯二酰一肼）并发光，在化学增强剂存在下光强度可以增大 1000 倍，通过将印迹放在照相底片上感光就可以检测辣根过氧化物酶的存在。
发光液（A液、B液）1：1配置（注意避光），用移液器吸取合适量的发光液至覆盖PVDF膜，ECL发光仪上曝光并采集图像。
