彗星实验

一．实验原理

    当各种内外源DNA损伤因子诱发细胞DNA链断裂时，DNA的超螺旋结构受到破坏，在细胞裂解液作用下，细胞膜、核膜等膜结构受到破坏，细胞内的蛋白质、RNA以及其它成分均扩散到细胞裂解液中，而核DNA由于分子量太大只能留在原位。在中性条件时，DNA片段可进入凝胶发生迁移，而在碱处理和碱性电解质的作用下，DNA发生解螺旋，损伤的DNA断链及片段被释放出来，由于这些DNA的分子量很小，所以在电泳过程中会离开核DNA向阳极移动，形成彗星状的图像，而未损伤的DNA部分保持球形。DNA受损越严重，产生的断片越多并且片段越小，电泳时迁移的DNA量也就越大，迁移距离越长，荧光显微镜下可观察到尾长增加、尾部荧光强度增强。在一定条件下，DNA迁移距离(彗星尾长)和DNA含量(荧光强度)分布与DNA损伤程度呈线性相关，因此，尾矩(尾部DNA的含量与尾长的乘积)成为定量测定单个细胞DNA损伤程度的主要依据。

二．实验步骤

将细胞加PBS，冲洗1次，离心后将细胞浓度调整为10⁶～10⁷个/ml，立即进行以下步骤。

(1) 胶板的制备

① 第一层胶的制备：将已预热56℃的80μl 0.5%正常熔点琼脂糖NMA（溶于无Ca2+，Mg2+的磷酸缓冲液PBS）滴到同样预热的载玻片的磨砂面，迅速盖上干净的盖玻片，4℃放置10min使其凝固。

② 第二层胶的制备：取10μl含1000个细胞的PBS和75μl 0.5%低熔点琼脂糖LMA（溶于无Ca2+，Mg2+的磷酸缓冲液PBS）在37℃混匀，然后轻轻揭去盖玻片，将含细胞的LMA滴到第一层胶板上，立即盖上干净的盖玻片，4 ℃ 放置10min使其凝固。

③ 第三层胶的制备：最后在凝固的LMA层上滴加85μl预热37 ℃ 的0.5% LMA，盖上盖玻片，使其凝固。第一层胶的主要目的是使第二层平整和附着紧密，第三层胶的目的是对第二层细胞起保护作用。

(2) 细胞裂解  移去盖玻片，将载玻片浸入新配置的细胞裂解液中至少裂解1h（在放第一片开始计时，再以同样的顺序取出，确保每张片子裂解时间相同）。此步骤的目的是溶解细胞膜及核膜，除去蛋白质、RNA等，仅存留核骨架。

(3) DNA碱解旋  细胞裂解后，取出载玻片，用PBS冲洗2次，以去掉载玻片表面高浓度的盐，然后将载玻片置于水平电泳槽中，倒入新配置的碱性电泳缓冲液，约覆过胶面0.25cm。碱解旋20min，以便使DNA在碱性条件下解螺旋形成单链DNA，使DNA断链，在电泳场中易于迁移。

(4) 单细胞电泳  在25v、300mA条件下电泳20min。

(5) 中和与染色  电泳完毕后，将载玻片取出，滤纸吸干电泳缓冲液，用Tris-HCl（pH7.5）中和15min。然后每片载玻片上滴加50μl 30μg/mL的溴化乙锭（EB）溶液，避光操作，盖上盖玻片，避光染色20min，即可观察。

(6) 试验结果观察与数据处理  EB染色后的样本尽快在荧光显微镜下观察并拍照电泳图谱。①计算拖尾率，并利用统计软件SPSS 10.0进行X2 检验。② 对每张组织片子的细胞，利用Comet Assay Software Pect (CASP 1.2.3 beta 1) 图像分析软件 (http://casplab.com/index.php) 对彗星图像进行指标分析，用 X(—) ±SE表示彗星全长( CL) 、尾长( T L) 、尾矩( TM) 和Olive 尾距( OTM)，并利用统计软件SPSS 10.0分析，显著性比较采用t 检验。③ 根据拖尾细胞中，彗星尾部DNA含量 ( TDNA%)，将细胞DNA 损伤程度分为5级。 0 级： 无损伤( 正常细胞) 及细胞损伤率< 5% ；1 级：低度损伤，5%~20% ；2 级：中度损伤，20%~40% ；3 级：高度损伤，40%~90%；4 级：重度损伤，> 95%。