线粒体膜电位

一、实验原理

线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1）是一种以JC-1为荧光探针，快速灵敏地检测细胞、组织或纯化的线粒体膜电位变化的试剂盒，可以用于检测线粒体的健康状态，也是用来检测细胞早期凋亡的常用方法。

JC-1是一种广泛用于检测线粒体膜电位△Ψm的理想荧光探针。JC-1染料表现出电势依赖性的积聚在线粒体内。正常线粒体内，JC-1聚集在线粒体基质中形成聚合物，聚合物发出强烈的红色荧光（Ex=585 nm, Em=590 nm）；不健康的线粒体由于膜电位的下降或丧失，JC-1只能以单体的形式存在于胞浆中，产生绿色荧光（Ex=514 nm, Em=529 nm）。因此颜色的变化非常直接的反映出线粒体膜电位的变化。线粒体的去极化程度也可以通过红/绿荧光强度的比例来衡量。

线粒体膜电势的破坏是细胞凋亡早期发生的一个标志性事件。细胞受到凋亡诱导后线粒体膜电位的变化使得膜的通透性发生改变。膜通透性的增加，使得线粒体蛋白包括细胞色素C、Smac/DIABLO、HtrA2/OMI、核酸内切酶G（EndoG）、凋亡诱导因子（AIF）等从线粒体基质释放到细胞浆。细胞色素C的释放伴随膜电位的完全丧失，进而引发细胞凋亡酶的级联效应。

二、实验方法

1、JC-1染色工作液的配制

取适量JC-1（200×），按照每50μL JC-1（200×）加入8mL 超纯水的比例稀释JC-1。剧烈震荡充分溶解并混匀JC-1。然后再加入2mL JC-1 染色缓冲液（5×），混匀后即为JC-1 染色工作液。

2、阳性对照的设置

CCCP（10mM）推荐按照1∶1000 的比例加入到细胞培养液中，稀释至10μM，处理细胞20分钟。对于大多数细胞，通常10μM CCCP处理20分钟后线粒体的膜电位会完全丧失，JC-1染色后观察应呈绿色荧光；而正常的细胞经JC-1染色后应显示红色荧光。

对于特定的细胞，CCCP 的作用浓度和作用时间可能有所不同，需自行参考相关文献资料决定。

3、线粒体膜电位检测

A．对于悬浮细胞

1）取1.0～6.0×105 细胞，重悬于0.5mL 细胞培养液中，细胞培养液中可以含血清和酚红。

2）加入0.5mL JC-1 染色工作液，颠倒数次混匀。细胞培养箱中37℃孵育20分钟。

3）孵育期间按照每1mL JC-1染色缓冲液（5×）加入4mL 蒸馏水的比例，配制适量的JC-1染色缓冲液（1×），并放置于冰浴。

4）37℃孵育结束后，600g 4℃离心3～4 分钟，沉淀细胞。弃上清，注意尽量不要吸除细胞。

5）用JC-1染色缓冲液（1×）洗涤2 次：加入1mL JC-1 染色缓冲液（1×）重悬细胞，600g 4℃离心3～4分钟，沉淀细胞，弃上清。再加入1mL JC-1 染色缓冲液（1×）重悬细胞，600g 4℃离心3～4分钟，沉淀细胞，弃上清。

6）再用适量JC-1 染色缓冲液（1×）重悬后，用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察，也可以用荧光分光光度计检测或流式细胞仪分析。

B．对于贴壁细胞：

   对于贴壁细胞，如果希望采用荧光分光光度计或流式细胞仪检测，可以先收集细胞，重悬后参考悬浮细胞的检测方法。

   1）对于六孔板的一个孔，吸除培养液，根据具体实验如有必要可以用PBS或其它适当溶液洗涤细胞一次，加入1ml细胞培养液。细胞培养液中可以含有血清和酚红。

   2）加入1ml JC-1染色工作液，充分混匀。细胞培养箱中37℃孵育20分钟。

   3）在孵育期间，按照每1ml JC-1染色缓冲液(5X)加入4ml蒸馏水的比例，配制适量的JC-1染色缓冲液(1X)，并放置于冰浴。

   4）37℃孵育结束后， 吸除上清，用JC-1染色缓冲液(1X)洗涤2次。

   5）加入2ml细胞培养液，培养液中可以含有血清和酚红。

   6）荧光显微镜或激光共聚焦显微镜下观察。