建立细胞耐药株

一、耐药株的建立

1. 浓度梯度递增间隙作用

(1). 接种细胞：对数生长期的细胞接种于12孔板，做1-2个复孔（可加入1%抗生素）

(2). 在37℃，5% CO₂的条件下培养过夜

(3). 细胞密度为70%-80% 时，加入目标药物，起始浓度为2ug/ml，继续培养

(4). 细胞出现死亡后，弃上清，PBS洗一遍，加入不含药物的完全培养基

(5). 在37℃，5% CO₂的条件下培养过夜

(6). 细胞恢复生长后，消化传代，同时以1 ug/ml的药物浓度作用细胞，继续培养过夜

(7). 细胞稳定生长后，逐渐加大药物浓度继续培养，一般药物浓度不超过10 ug/ml。筛选到只有10%的活细胞时，撤药，加铺饲养层，继续培养。

(8). 待耐药细胞长出克隆团并且克隆团能铺满显微镜下50%视野时，将克隆团消化，重铺，继续培养。

(9). 细胞恢复生长，密度为70-80%时，加药维持（10ug/ml）两周后，得到稳定耐药株。

2 .大剂量间隙作用　

(1). 接种细胞：对数生长期的细胞接种于6cm培养皿中，生长至密度为70%-80% 时，加入10 ug/ml的药物作用2小时，弃去培养液，PBS清洗2遍，更换不含药物的完全培养基，常规培养。

(2). 待细胞恢复生长，再次予以10 ug/m的l药物作用细胞作用2小时，重复上述过程，直到细胞能够在10 ug/m药物浓度中稳定生长，用此方法获得的稳定耐药株。

注意事项：

1．当筛选到只有10%的活细胞并撤药后，若细胞增殖明显，可挑出一部分，作为初筛株进行传代冻存。余下的继续加药，药物浓度为撤药之前的最高浓度。若细胞长势不明显，可加入适量饲养层细胞，促进耐药细胞长出克隆团。

二、MTT检测细胞对化疗药物敏感性,测定细胞耐药指数:　

(1). 将处于对数生长期的正常株细胞和耐药株细胞，分别孔接种于96孔板中，每孔8000个细胞，细胞贴壁后，加入不同浓度的药物，每个浓度设６ 个复孔，另设６ 个不加药物的对照组，继续培养过夜.

(2). MTT 法检测药物各个浓度的吸光值（A490），按照公式：抑制率＝（1-加药组平均A值）/对照组平均A值×100%，计算每种药物的生长抑制率，确定半数抑制质量浓度（IC50）.

(3). 根据公式：耐药指数（RI） ＝耐药组IC50／亲代细胞IC50，计算药物的RI值。

三、绘制细胞生长曲线　

(1). 将处于对数生长期的正常株细胞和耐药株细胞，分别已每孔8000个细胞孔接种于7块96孔板中，37℃，5% CO₂培养箱中培养，每种细胞设６ 个复孔，

(2). 每24h取1块96孔板MTT法检测A490值，连测7天。

(3). 以培养时间为横轴，A值平均值为纵轴，绘制生长曲线。