稳转细胞系筛选

一、实验原理：

通过将外源DNA/shRNA克隆到带有某种抗性基因的载体上，重组载体被转染至宿主细胞并整合到其染色体中，并能随细胞分裂稳定传递下去，再用载体中所含抗性基因进行筛选。

二、实验方法

2.1确定puromycin最优筛选浓度

1）取对数生长期的细胞，用培养基制成细胞密度为1.5×10⁵ 个/ml的细胞悬液；

2）96孔培养板每孔加入100μl细胞悬液（使每孔细胞数在1.5×10⁴个），37℃培养箱中培养过夜；

3）分别加入不同浓度puromycin，使终浓度分别为0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 、1、1.5、2μg/ml，每日检查细胞活力，筛选出最佳浓度。

2.2 病毒MOI筛选

1）细胞扩培。待细胞长到对数生长期时，铺板于96孔板中，铺板密度为5000/孔；

2）24 h后进行病毒感染；

3）病毒滴度为1.5E+8TU/ml，分别以病毒MOI值6.25、12.5、25、50、100、200、400，计算所需病毒颗粒的量，感染细胞；

4）感染72 h、96h后，荧光显微镜下观察病毒的感染效率；

5）MOI筛选结果显示，感染72h后，病毒MOI=6.25，感染效率已达到90%以上，足以进行后续实验。

2.3慢病毒感染

1）病毒感染前一天将细胞接种于24孔细胞培养板，感染当日细胞汇合度达到30～60％；

2）以MOI值为6.25对细胞进行病毒感染，37℃培养箱中培养24h后更换新鲜培养基；

3）感染48h后可检测到GFP的表达。

2.6 筛选细胞：

1）病毒感染48h后，更换含最优浓度(本次筛选的最佳浓度为0. 4 μg/ml)puromycin的培养基；

2）每2-3天更换新鲜含puromycin的培养基，以替换含大量死细胞的培养基。直到抗性群落能被识别出；

3）待抗性细胞长满以后，传代，扩大培养，鉴定、冻存。

2.4  RT验证稳转株敲降/过表达效率。