稳转细胞系筛选
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稳转细胞系筛选
一、实验原理:
通过将外源DNA/shRNA克隆到带有某种抗性基因的载体上,重组载体被转染至宿主细胞并整合到其染色体中,并能随细胞分裂稳定传递下去,再用载体中所含抗性基因进行筛选。
二、实验方法
2.1确定puromycin最优筛选浓度
1)取对数生长期的细胞,用培养基制成细胞密度为1.5×105 个/ml的细胞悬液;
2)96孔培养板每孔加入100μl细胞悬液(使每孔细胞数在1.5×104个),37℃培养箱中培养过夜;
3)分别加入不同浓度puromycin,使终浓度分别为0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 、1、1.5、2μg/ml,每日检查细胞活力,筛选出最佳浓度。
2.2 病毒MOI筛选
1)细胞扩培。待细胞长到对数生长期时,铺板于96孔板中,铺板密度为5000/孔;
2)24 h后进行病毒感染;
3)病毒滴度为1.5E+8TU/ml,分别以病毒MOI值6.25、12.5、25、50、100、200、400,计算所需病毒颗粒的量,感染细胞;
4)感染72 h、96h后,荧光显微镜下观察病毒的感染效率;
5)MOI筛选结果显示,感染72h后,病毒MOI=6.25,感染效率已达到90%以上,足以进行后续实验。
2.3慢病毒感染
1)病毒感染前一天将细胞接种于24孔细胞培养板,感染当日细胞汇合度达到30~60%;
2)以MOI值为6.25对细胞进行病毒感染,37℃培养箱中培养24h后更换新鲜培养基;
3)感染48h后可检测到GFP的表达。
2.6 筛选细胞:
1)病毒感染48h后,更换含最优浓度(本次筛选的最佳浓度为0. 4 μg/ml)puromycin的培养基;
2)每2-3天更换新鲜含puromycin的培养基,以替换含大量死细胞的培养基。直到抗性群落能被识别出;
3)待抗性细胞长满以后,传代,扩大培养,鉴定、冻存。
2.4 RT验证稳转株敲降/过表达效率。