软琼脂克隆形成
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软琼脂克隆形成
一、实验原理:
某些恶性肿瘤细胞,不仅在贴壁状态下能增殖,在悬浮状态下也能增殖,其在软琼脂中形成克隆能力反映其恶性增殖程度。
二、实验方法
1. 用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞,把细胞悬浮在培养基中以5×103/ml备用;
2. 用蒸馏水分别制备出1.2%和0.7%两个浓度的低溶点琼脂糖液,高压灭菌后,维持在40℃中不会凝固;
3. 按1:1比例使1.2%的琼脂糖和2×DMEM培养基(含有2×抗生素和20%的小牛血清)混合后,取1mL混合液注入6孔板中,冷却凝固,可作底层琼脂置CO2温箱中备用;
4. 按1:1比例让0.7%的琼脂糖和2×DMEM培养基在无菌试管中相混以后,再向管中加入0.2mL的细胞悬液,充分混匀,注入铺有1.2%琼脂糖底层平皿中,逐形成双琼脂层。待上层琼脂凝固后,置入37℃ 5%CO2温箱中培养10~14天;
5. 弃上清,用PBS浸洗2次,冰乙醇固定30min;
6. 弃固定液,加2ml结晶紫染色10-30min;
7. 用PBS清洗,计数;
8. 计算:克隆形成率=克隆数/接种细胞数*100%。