软琼脂克隆形成

一、实验原理：

某些恶性肿瘤细胞，不仅在贴壁状态下能增殖，在悬浮状态下也能增殖，其在软琼脂中形成克隆能力反映其恶性增殖程度。

二、实验方法

1. 用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，把细胞悬浮在培养基中以5×103/ml备用；

2. 用蒸馏水分别制备出1.2%和0.7%两个浓度的低溶点琼脂糖液，高压灭菌后，维持在40℃中不会凝固；

3. 按1:1比例使1.2%的琼脂糖和2×DMEM培养基(含有2×抗生素和20%的小牛血清)混合后，取1mL混合液注入6孔板中，冷却凝固，可作底层琼脂置CO2温箱中备用；

4. 按1:1比例让0.7%的琼脂糖和2×DMEM培养基在无菌试管中相混以后，再向管中加入0.2mL的细胞悬液，充分混匀，注入铺有1.2%琼脂糖底层平皿中，逐形成双琼脂层。待上层琼脂凝固后，置入37℃ 5%CO2温箱中培养10～14天；

5. 弃上清，用PBS浸洗2次，冰乙醇固定30min；

6. 弃固定液，加2ml结晶紫染色10-30min；

7. 用PBS清洗，计数；

8. 计算：克隆形成率=克隆数/接种细胞数*100%。