免疫荧光
产品编号 | 产品名称 | 规格 | 价格 |
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免疫荧光
1. 细胞种植:将细胞消化后按照所需浓度种植于48孔板,置于37°C二氧化碳培养箱培养过夜。
2. 固定:取出48孔板,弃去培养基,每孔加入PBS 500μl,静置5min,吸走液体,每孔加入200μl 的4%多聚甲醛固定液,室温固定30min。
3. 洗涤:每孔加入PBS 500μl,静置5min,吸走液体,重复3次。
4. 通透:每孔加入200μl 的0.1% Triton x-100,室温静置15min。(膜表达的蛋白鉴定建议不通透,具体参考抗体说明书)
5. 洗涤:每孔加入PBS 500μl,静置5min,吸走液体,重复3次。
6. 封闭:每孔加入500μl 5%牛血清封闭液,37℃孵育2h或者置于冷藏冰箱中过夜,弃去液体。
7. 一抗:每孔加入200μl采用2%牛血清稀释的抗体(稀释比例参考抗体说明书),37°C静置2h或者4℃过夜。
8. 洗涤:PBST每孔500μl,静置5min,吸走板中液体,重复3次。
9. 封闭:每孔加入200μl 5%牛血清封闭液,室温封闭15min。(本底高的可以加这一步)
10. 二抗:每孔加入200μl采用2%牛血清稀释的二抗(种属和一抗的要对应,举例:一抗是来源是兔抗X,二抗就用Y 抗兔-荧光,稀释比例参考抗体说明书),37℃避光孵育1h。
11. 洗涤:PBST每孔500μl,静置5min,吸走板中液体,重复3次。
12. 染核:Hoechst 浓度2μg/ml,每孔200 μl,室温避光染色15min。
13. 洗涤:PBST每孔500μl,静置5min,吸走板中液体,重复3次。
14. 拍照:洗涤完毕每孔加入200μl PBS,将细胞置于显微镜下观察,选择所需倍数,拍照保存。