慢病毒包装
| 产品编号 | 产品名称 | 规格 | 价格 |
|---|
慢病毒包装
Part I 过表达载体构建
1. 基因信息的查询
根据基因序列号......查出基因的序列，找出基因的ORF，根据GV208的载体图谱选择合适的酶切位点，进行设计引物，从人的cDNA中，通过PCR的方式克隆目的基因。
2. PCR扩增目的基因片段
(1) PCR反应体系
试剂 | 体积(µl) |
ddH2O | 12.4 |
5×Taq buffer | 4 |
dNTPs (2.5 mM) | 1.6 |
Primer-F (10 μM) | 0.4 |
Primer-R (10 μM) | 0.4 |
Template (10 ng/μl) | 1 |
Taq polymerase | 0.2 |
(2) PCR反应条件
3. 重组质粒构建
(1) 酶切反应 将PCR片段和过表达载体分别进行酶切。
(2) 连接反应 将PCR产物与线性化的过表达载体进行连接。
成分 | 体积(µl) |
10×T4 Ligase Buffer | 1 |
T4 Ligase | 1 |
PCR products | 7 |
Linearized vector | 1 |
4. 制备感受态细胞
5. 转化
6. 阳性克隆的PCR鉴定
7. 阳性克隆测序
Part II 干扰慢病毒载体构建
1. shRNA片段的设计和合成
根据基因序列设计shRNA，合成shRNA片段
2. 分别用100 μl退火Buffer (10 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, pH 8.0)充分溶解合成DNA片段。分别对应各取2 μl DNA引物片段，加入至16 μl退火Buffer中，充分混匀，100℃退火自然冷却至室温。退火产物分别用无菌水稀释100倍。
3. 载体pLVX-shRNA2-Puro用限制性内切酶EcoR I + BamHI酶切。酶切体系如下：
Components | volume |
pLVX-shRNA2-Puro | 2 μg |
10×Buffer | 3 μl |
EcoR I + BamHI | 各0. 5μl |
ddH2O补足 | 30 μl |
37℃反应40 min，然后电泳
4. 质粒pLVX-shRNA2-Puro回收大片段与shRNA-目的基因的稀释退火产物的连接，22℃水浴反应过夜。连接反应体系如下：
Components | Volume |
pLVX-shRNA2-Puro大片段 | 1 μl |
shRNA退火产物 | 1 μl |
10×DNA Ligase Buffer | 1 μl |
T4 DNA Ligase | 1 μl |
ddH2O | 6 μl |
5. 各取10 μl过夜连接产物转化100 μl Stbl3感受态细胞：将连接产物与感受态细胞混匀后冰浴30 min，42℃热激45 s，立即置冰上放置2 min, 加入预热至室温的400 μl LB培养基，200 rpm，37℃恒温摇床培养1 h，4000 rpm离心1 min，弃去400 μl培养上清，剩余100 μl用移液器混匀后均匀涂布于含100 μg/ml Ampicillin抗性的LB平板上，倒置，37℃恒温培养箱培养过夜。
6. 分别挑取3个单菌落接种于含5 ml，100 μg/ml Ampicillin抗性的LB培养液中，250 rpm，37℃恒温摇床培养过夜，用小量质粒抽提试剂盒抽提质粒，并分别用做酶切鉴定。
挑取酶切鉴定正确的阳性菌去测序，测序引物为U6-F: 5‘-TACGATACAAGGCTGTTAGAGAG-3’
Part III 慢病毒包装与滴度检测
1. Lenticirus病毒包装
1) 转染前24h用胰蛋白酶消化对数生长期的293T细胞，以含10%血清的培养基调整细胞密度2.5×105接种于六孔板中，37℃、5%CO2培养箱内培养。
2) 转染前2 h将细胞培养基更换为无血清培养基。
3) 向灭菌离心管中加入所制备的DNA溶液(pGC-LV及pHelper)，与相应体积的Opti-MEM 混合均匀，调整总体积为2.5 ml，在室温下温育5 min。
4) 将Lipofectamine 2000试剂轻柔摇匀，取100 µl Lipofectamine 2000试剂在另一管中与2.4 ml Opti-MEM 混合，在室温下温育5 min。
5) 把稀释后的DNA与稀释后的Lipofectamine 2000进行混合，轻轻地颠倒混匀，不要振荡。必须在5 min之内混合。
6) 混合后，在室温下温育20 min，以便形成DNA与Lipofectamine 2000稀释液的转染复合物。
7) 将DNA与Lipofectamine 2000混合液转移至293T细胞的培养液中，混匀，于37℃, 5% CO2细胞培养箱中培养。
8) 培养8 h后倒去含有转染混和物的培养基，每瓶细胞加入20 ml的PBS液，轻轻左右晃动一下培养瓶以洗涤残余的转染混和物，然后倒去。
9) 每瓶细胞中加入含10%血清的细胞培养基25 ml，于37℃、5% CO2培养箱内继续培养48 h。
10) 收集上清，1000 rpm离心5min，弃去细胞碎片，上清液以0.45 μm PVDF滤器过滤至50 ml圆底离心管中。
11) 4℃，50000 g高速离心2 h，离心后可用记号笔对病毒沉淀做好标记。
12) 小心弃去上清，晾干，按200 μl/10cm培养皿的量加入PBS重悬病毒沉淀，室温静置2 h，然后用移液器轻轻地吹匀(避免产生气泡)，继续室温放置30 min，按每次使用的病毒量分装到洁净的1.5 ml EP管中，-80℃冰箱保存。
2. Lenticirus病毒滴度测定
1) 在滴度测定前一天取96孔板，加入3×104cell/孔 293T细胞。
2) 用DMEM完全培养基10倍梯度稀释病毒。具体做法如下：取96孔板，每孔含有90 μl培养基，第一横排孔每孔加入10 μl待测病毒原液，混匀后吸取10 μl混合液至第二横排孔（混匀时尽量不要产生气泡），如此稀释至第六横排孔。
滴定量 |
|
|
|
|
| …… |
病毒液 | 5or10 | 10 | 10 | 10 | 10 | …… |
DMEM完全培养基 |
|
|
|
|
| …… |
上样量 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | …… |
注意：每次移液都必须换用新的枪头，否则就会将枪头外面的病毒带入到下一孔，导致过高估计滴度的终点。
3) 吸10 μl病毒混合液加入到相对应的96孔板中。
4) 经72 h感染，借用荧光显微镜计数荧光细胞情况。一般情况下(如果观察不清楚可先换PBS再进行观察），在最高稀梯度m的孔数出N（N<10）个带荧光的细胞，则病毒滴度为N×10m/μl（m为稀释倍数），即病毒滴度为N×10m+3TU/ml，若N>10，则需继续稀释。(如果病毒荧光较弱可加入polybrene以便增强病毒感染细胞的能力)。
