流式周期
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流式周期
一、实验原理:
细胞周期是细胞内一种隐藏时钟,精心安排着细胞的一生——生长与分裂周期。
细胞周期作为细胞内外信号交互作用的精密调控过程,其驱动运转的引擎就是以CDKs和Cyclins为核心的细胞周期蛋白与细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶。
在细胞周期的不同时期,不同的Cyclin-CDK复合物驱动着细胞周期的运转。然而,细胞一旦跳出此轮回,必然会处于增殖失控的状态,给机体造成不可避免地伤害,肿瘤细胞便是如此。那么为了避免细胞无限制增殖,细胞周期中必然也存在着刹车系统。而CDKs抑制蛋白(CDKIs)就对细胞周期起着抑制的作用。
细胞周期的完成,最直观的结果,就是细胞一分为二。为了保证细胞分裂的忠实性,细胞设置了一系列关卡,就是所谓的细胞周期检查点(check point)。通常在研究某个基因表达或者药物对细胞周期的影响,要么检测相关明星分子(如Cyclin、CDK、CKI以及Rb通路和p53通路的明星核心分子);要么进行PI(碘化丙啶)染色实验,PI是一种插入性核酸荧光染料,能选择性地嵌入核酸DNA双链螺旋的碱基之间并发出荧光。至于后者,因PI结合的量与DNA的含量成正比例关系,可通过流式细胞仪来了解细胞周期各个阶段的DNA分布状态,从而计算出各个细胞周期时相的百分含量,了解细胞的增殖能力。在肿瘤病理学研究中,通常以S期细胞比率作为判断肿瘤增殖状态的指标。
二、实验方法
1. 用不含EDTA的0.25%胰酶消化细胞,终止消化后收集细胞,1500rpm,5min,去上清,PBS重悬润洗2次;
2. 1500rpm,5min,去上清,100ul PBS重悬细胞,缓慢加入700ul预冷的80%乙醇,使乙醇终浓度为70%;
3. 4℃固定4h以上;
4. 1500rpm,5min,预冷PBS润洗2次;
5. 加入100ul RNase(50ug/ml),37℃水浴30min;
6. 加入400ul PI(50ug/ml),4℃避光染色30min;
7. 流式细胞仪检测。