流式周期

一、实验原理：

细胞周期是细胞内一种隐藏时钟，精心安排着细胞的一生——生长与分裂周期。

细胞周期作为细胞内外信号交互作用的精密调控过程，其驱动运转的引擎就是以CDKs和Cyclins为核心的细胞周期蛋白与细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶。

在细胞周期的不同时期，不同的Cyclin-CDK复合物驱动着细胞周期的运转。然而，细胞一旦跳出此轮回，必然会处于增殖失控的状态，给机体造成不可避免地伤害，肿瘤细胞便是如此。那么为了避免细胞无限制增殖，细胞周期中必然也存在着刹车系统。而CDKs抑制蛋白（CDKIs）就对细胞周期起着抑制的作用。

细胞周期的完成，最直观的结果，就是细胞一分为二。为了保证细胞分裂的忠实性，细胞设置了一系列关卡，就是所谓的细胞周期检查点（check point）。通常在研究某个基因表达或者药物对细胞周期的影响，要么检测相关明星分子（如Cyclin、CDK、CKI以及Rb通路和p53通路的明星核心分子）；要么进行PI（碘化丙啶）染色实验，PI是一种插入性核酸荧光染料，能选择性地嵌入核酸DNA双链螺旋的碱基之间并发出荧光。至于后者，因PI结合的量与DNA的含量成正比例关系，可通过流式细胞仪来了解细胞周期各个阶段的DNA分布状态，从而计算出各个细胞周期时相的百分含量，了解细胞的增殖能力。在肿瘤病理学研究中，通常以S期细胞比率作为判断肿瘤增殖状态的指标。

二、实验方法

1. 用不含EDTA的0.25%胰酶消化细胞，终止消化后收集细胞，1500rpm，5min，去上清，PBS重悬润洗2次；

2. 1500rpm，5min，去上清，100ul PBS重悬细胞，缓慢加入700ul预冷的80%乙醇，使乙醇终浓度为70%；

3. 4℃固定4h以上；

4. 1500rpm，5min，预冷PBS润洗2次；

5. 加入100ul RNase（50ug/ml），37℃水浴30min；

6. 加入400ul PI(50ug/ml)，4℃避光染色30min；

7. 流式细胞仪检测。