Transwell侵袭

一、实验原理：

将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。我们将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。

应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。侵袭实验中使用到的Matrigel 是从小鼠EHS肉瘤中提取的基质成分，含有LN、IV型胶原、接触蛋白和肝素硫酸多糖，铺在无聚乙烯吡硌烷酮的聚碳酸酯滤膜上，能在DMEM培养基中重建形成膜结构，这种膜结构与天然基质膜结构极为相似。

Transwell小室的滤膜孔径一般为8μm，在侵袭实验中，膜孔都被Matrigel覆盖，细胞不能自由穿过，必须分泌水解酶，并通过变形运动才能穿过这种铺有Martrigel 的滤膜，这与体内情况较为相似。细胞欲进入下室，先要分泌基质金属蛋白酶（MMPs）将基质胶降解，方可通过聚碳酸酯膜。计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的侵袭能力。

二、实验方法

1. 取处理好的细胞，加入3ml PBS清洗细胞，0.25%胰酶分别消化收集，1000rpm，5min离心，去上清，PBS润洗两次，清洗掉残余血清。

2. 用无血清的培养基重悬细胞，细胞计数板计数，无血培养基稀释细胞浓度至3×10⁵/ml，备用。

3. 将Matrigel在4℃提前一天融化， transwell小室、24孔培养板和枪头在-20℃过夜预冷；

4. 用的无血清培养基稀释Matrigel至终浓度1mg/ml，冰上操作；

5. 在24孔板中加入4℃预冷800μl 的完全培养基（含双抗），并放入transwell小室，在transwell小室上室底部中央垂直加入100μl终浓度为1mg/ml的Matrigel，37℃温育4-5h使其干成胶状，待Matrigel干成胶状后在transwell上室分别接入200μl各组细胞悬液，37℃，5% CO₂培养箱培养24h；

6. 取出transwell，用PBS小心清洗小室一遍，用70％冰乙醇溶液固定细胞1h；

7. 用0.5％结晶紫染液染色，室温中放置20min，PBS清洗一下，用干净的棉球将上室一侧的未迁移的细胞擦干净，显微镜下观察拍照(200X)。