Transwell迁移
产品编号 | 产品名称 | 规格 | 价格 |
---|
Transwell迁移
一、实验原理:
将Transwell小室放入培养板中,小室内称上室,培养板内称下室,上室内盛装上层培养液,下室内盛装下层培养液,上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。我们将细胞种在上室内,由于聚碳酸酯膜有通透性,下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞,从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。
应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜,就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。侵袭实验中使用到的Matrigel 是从小鼠EHS肉瘤中提取的基质成分,含有LN、IV型胶原、接触蛋白和肝素硫酸多糖,铺在无聚乙烯吡硌烷酮的聚碳酸酯滤膜上,能在DMEM培养基中重建形成膜结构,这种膜结构与天然基质膜结构极为相似。
Transwell小室的滤膜孔径一般为8μm,在侵袭实验中,膜孔都被Matrigel覆盖,细胞不能自由穿过,必须分泌水解酶,并通过变形运动才能穿过这种铺有Martrigel 的滤膜,这与体内情况较为相似。细胞欲进入下室,先要分泌基质金属蛋白酶(MMPs)将基质胶降解,方可通过聚碳酸酯膜。计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的迁移能力。
二、实验方法
1. 取处理好的细胞,加入3ml PBS清洗细胞,0.25%胰酶分别消化收集,1000rpm,5min离心,去上清,PBS润洗两次,清洗掉残余血清;
2. 用无血清培养基重悬细胞,细胞计数板计数,无血清培养基稀释细胞浓度至3×105cell/ml,备用;
3. 在24孔板中预先加入800μl 完全培养基(含双抗),并放入transwell小室,1h后在transwell上室分别接入200ul各组细胞悬液,37℃,5% CO2培养箱培养24h;
4. 取出transwell,用PBS小心清洗小室一遍,用70%冰乙醇溶液固定细胞1h;
5. 用0.5%结晶紫染液染色,室温中放置20min,PBS清洗一下,用干净的棉球将上室一侧的未迁移的细胞擦干净,显微镜下观察拍照(200X);