流式凋亡

一、实验原理：

正常细胞的表面由不对称分布在质膜内叶和外叶上的脂质组成。这些脂质之一磷脂酰丝氨酸（PS），通常仅分布于质膜的内叶，因此仅暴露于细胞质中。然而，在细胞凋亡过程中，脂质不对称性消失并且PS暴露在质膜的外部小叶上。 Annexin V是一种36 kDa的钙依赖性的磷脂结合蛋白，能够与PS结合。因此，荧光标记的Annexin V可用于检测暴露于早期凋亡细胞外部的PS。Annexin V还可以染坏死细胞，因为这些细胞的膜破裂，使Annexin V可以进入整个质膜，但是Annexin V就无法区分坏细胞死（中晚期凋亡细胞）和早期凋亡细胞。因此，通过与碘化丙啶（PI）共染色，可以将凋亡细胞与坏死细胞（中晚期凋亡细胞）区分开，因为早期凋亡细胞和活细胞的细胞膜仍然完整，PI能进入坏死细胞（中晚期凋亡细胞）但是被早期凋亡细胞排除在外。该方案描述通过Annexin V结合和PI摄取，然后通过流式细胞仪检测和量化凋亡细胞。

二、实验方法

1. 收集细胞进行细胞凋亡检测：用不含EDTA的胰酶消化收集后(注：胰酶消化时间不宜过长，否则会影响细胞膜上磷脂酰丝氨酸与Annexin V-FITC的结合)，在室温中，1500rpm离心5 min，收集细胞；

2. 细胞洗涤：用预冷1*PBS（4℃）重悬细胞一次，1500rpm离心5 min，洗涤细胞；

3. 加入300µL的1*Binding Buffer悬浮细胞；

4. Annexin V-FITC标记：加入5µL的Annexin V-FITC混匀后，避光，室温孵育15 min；

5. PI标记：再加入10 µL的PI染色，轻轻混匀细胞，于避光条件下室温孵育10 min；

6. 流式细胞仪检测，FlowJo 7.6软件分析。