克隆形成
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克隆形成
一、实验原理:
克隆形成实验是肿瘤细胞学研究中的一种常用技术,其原理是将细胞分离成单细胞悬液,在培养基上接种培养,根据集落形成数量和大小来检测细胞增殖能力和致瘤性。该实验可用来研究肿瘤细胞的增殖能力、侵袭性,探讨细胞对不同杀伤因素的敏感性。
根据培养基是否需要软琼脂,克隆形成实验可以分为平板克隆形成实验(PCF)和软琼脂克隆形成实验(SACF)。PCF是直接将细胞接种于培养瓶、培养皿中,优点为操作简便、细胞间分泌的促生长因子可在培养液中扩散、克隆形成率高,适用于贴壁生长的细胞; 缺点为细胞在 贴壁前易于移动。SACF 是采用半固体培养基模拟体内生长环境,适用于悬浮细胞及不依赖于贴壁生长的肿瘤细胞。在悬浮状态下不能增殖的细胞(如正常成纤维细胞)不适用此法。
二、实验方法
1. 取对数生长期的单层培养细胞,用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞,把细胞悬浮在10%胎牛血清的培养液中备用;
2. 将细胞悬液作梯度倍数稀释,以适当的细胞密度(根据增殖能力)接种于3.5cm培养皿中,每皿接种200个细胞;
3. 轻轻转动,使细胞分散均匀,置37℃, 5% CO2及饱和湿度的环境下,静置培养2-3周;
4. 经常观察,当培养皿中出现肉眼可见的克隆时,终止培养;
5. 弃去上清液,用PBS小心浸洗2次;
6. 加4%多聚甲醛室温固定15分钟;
7. 去固定液,加适量结晶紫染色液染10分钟,再用流水缓慢洗去染色液,空气干燥;
8. 将平皿倒置拍照,用肉眼直接计数克隆,或在显微镜(低倍镜)计数大于10个细胞的克隆数;
9. 计算克隆形成率:克隆形成率=克隆数/接种细胞数*100%。