克隆形成

一、实验原理：

克隆形成实验是肿瘤细胞学研究中的一种常用技术，其原理是将细胞分离成单细胞悬液，在培养基上接种培养，根据集落形成数量和大小来检测细胞增殖能力和致瘤性。该实验可用来研究肿瘤细胞的增殖能力、侵袭性，探讨细胞对不同杀伤因素的敏感性。

 根据培养基是否需要软琼脂，克隆形成实验可以分为平板克隆形成实验（PCF）和软琼脂克隆形成实验（SACF）。PCF是直接将细胞接种于培养瓶、培养皿中，优点为操作简便、细胞间分泌的促生长因子可在培养液中扩散、克隆形成率高，适用于贴壁生长的细胞; 缺点为细胞在 贴壁前易于移动。SACF 是采用半固体培养基模拟体内生长环境，适用于悬浮细胞及不依赖于贴壁生长的肿瘤细胞。在悬浮状态下不能增殖的细胞（如正常成纤维细胞）不适用此法。

二、实验方法

1. 取对数生长期的单层培养细胞，用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，把细胞悬浮在10%胎牛血清的培养液中备用；

2. 将细胞悬液作梯度倍数稀释，以适当的细胞密度（根据增殖能力）接种于3.5cm培养皿中，每皿接种200个细胞；

3. 轻轻转动，使细胞分散均匀，置37℃， 5% CO₂及饱和湿度的环境下，静置培养2-3周；

4. 经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养；

5. 弃去上清液，用PBS小心浸洗2次；

6. 加4%多聚甲醛室温固定15分钟；

7. 去固定液，加适量结晶紫染色液染10分钟，再用流水缓慢洗去染色液，空气干燥；

8. 将平皿倒置拍照，用肉眼直接计数克隆，或在显微镜(低倍镜)计数大于10个细胞的克隆数；

9. 计算克隆形成率：克隆形成率=克隆数/接种细胞数*100%。