1. 在最适的环境下培养细胞 (细胞密度在临界对数生长期)加入 BrdU至终浓度为 30 μM。孵育 30-60分钟。注意: BrdU是光敏型，所以必须在黑暗中加入（细胞加了BrdU以后也可能光敏感—因此也在黑暗中培养）。加入BrdU的时间和浓度根据细胞的类型和复制时间来确定，范围在15分钟到2个小时，浓度从10 μM到100 μM ，例如我们处理鼠胚胎成纤维细胞为30 μM 处理60min。

2. 除去 BrdU. 用 PBS洗一次。

3. 可渗透化处理细胞: 用0.3 ml PBS轻轻的洗涤细胞, 然后慢慢加入0.7 ml 预冷的100%乙醇。轻轻混匀。在4 °C 至少静置1 h。注意: 可渗透化处理细胞后细胞样品可以4 °C储存于乙醇中2个星期。

4. PBS洗涤3次并且移去上清。

5. 加入 0.5 ml 2 N HCl/0.5% Triton X-100 室温孵育 30 min。

6. PBS洗涤3次并且移去上清，加入0.5 ml 0.1 M四硼酸钠处理细胞2 min。

7. 用PBS/ 1 % BSA洗细胞一次

8. 用0.5% Tween-20/1%BSA/PBS混合10-20 μl (1 μg/106 cells) anti-BrdU，加入孔板，在室温下避光孵育一个小时。

9. PBS/ 1 % BSA洗一次。

10. 0.5% Tween-20/1%BSA/PBS混合5 μl (1 μg/106 cells) 羊抗鼠二抗-FITC（根据BrdU的种属选择），室温下避光孵育30分钟。

11. 去上清，加入50ug/ml的RNASE A 室温孵育30分钟后加入含有20 μg/ml  碘化丙啶(PI 母液) 的0.5 ml PBS 重悬细胞（RNASE A步骤可略），避光室温孵育半个小时。

       12. 另设置对照1. 只用 PI 染细胞.；2. Cells没有加 BrdU, 只加抗体。